2021年，經濟合作與發展組織（OECD）正式發布了一項具有裏（lǐ）程碑意義的測試指南——第497號（TG 497），首次將一套完整的綜合體外測試（shì）方案納入國際毒理學評價體係，該（gāi）方案（àn）用於化學品的皮膚致敏性評估，被視為（wéi）可完全替代動物實驗。緊接著，OECD於2022年又發布了另一項綜合體外測試方案TG 467，用於評估眼部腐蝕與刺激。盡管目前僅有這兩項指南作為完全替代相應動物實驗的方案被納入官方毒理測試評價體係，但它們的推出仍標誌著在部分領域，非動物方法已由“輔助性工具”躍升為決策層麵（miàn）的主導（dǎo）手段，實現了特定毒理終點的完全替代。但正如TG 497的成功案例所揭示的那樣，實現“完全替代”的道路並非坦途——每一個被采納的替代方案（àn）都需（xū）要在對生物機（jī）製深入理解的（de）基礎上，實（shí）現方法的標（biāo）準化、完成多中心驗證及確保（bǎo）替代方案與（yǔ）人（rén）體真實反應的高度一致性。因（yīn）此，目前替代成功更多是個別突（tū）破而非普遍現象。在了解TG 497前，先簡要了解下皮膚致敏的（de）過程和機理：化合物引發皮膚致敏反應主要（yào）涉及三個連續的（de）生物學過程。

首先（xiān），多數低分（fèn）子質量（通常小於500道爾頓）的化學物質本身不能（néng）被免疫係統直接識別，因此它們需首先與皮膚中的蛋白（bái）質發生共價結合，形成所謂的半抗原複（fù）合物。這種修飾後（hòu）的蛋白質（zhì）結構被免疫係（xì）統識別為“外來”，成為真正具有免疫原性的抗原，進而觸發（fā）遲發型（IV型）變（biàn）態反應，即皮膚致敏反應（yīng）的起點；

第二步是角質形成細胞的應激激活。在接觸化學（xué）物質後，表皮中的角質形成（chéng）細胞會被刺激而激活，釋放一係列促炎因子，如各種白細（xì）胞（bāo）介素和胸腺基質淋巴細胞生成素等。這些細胞因子的釋放不（bú）僅增強局部炎症反應，還具有重要的免疫信號功能，可吸引並激活樹突狀細胞及朗格漢斯細胞向接觸部位遷移；

第三步是樹突（tū）狀細胞的激活與抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在（zài）接觸刺激部位攝取半抗原複合物後，成熟並遷移至區（qū）域（yù）性淋巴結（jié），在那裏與T細胞相互作（zuò）用，完成抗原（yuán）提呈，最終形成免疫記憶。該免疫記憶使得個體在（zài）後續暴露相同化學（xué）物質時迅（xùn）速出現過敏反應，表現為（wéi）典型（xíng）的（de）過敏性接觸性皮炎。

從皮膚首次（cì）接觸某種化學物質，到反複暴露後誘發過敏性接觸性皮炎的全過程，在現代毒理學中被統稱為“有害結（jié）局通路”。該通路由（yóu）多個生物學過程構成，其中的關鍵環節被稱為“關鍵事件（jiàn）”。由上（shàng）文可知（zhī），皮膚致敏的有（yǒu）害結局通路包含三（sān）個關鍵事件，即（1）半抗原形成；（2）角質形成細胞的激活和（3）樹突狀細胞激活。在所有已（yǐ）知的“有害結局通路”中，皮膚致敏性“有（yǒu）害結局通路”是建立最早、機製最明確，且（qiě）相對容易進行體外模擬的免疫（yì）反應，因此成為了（le）替（tì）代方法開發的突破口。

在傳統毒理學評估中，皮膚致敏性通（tōng）常依賴（lài）動物整體反應模型進行判斷，代表性方法包括（kuò）：（1）豚鼠皮膚（fū）致敏試驗，用於綜合評估致敏起始階段與激發階段的反應；（2）局部淋巴結試驗，聚焦於皮膚致敏階段。以局部淋巴結試驗（yàn）為例，一次標（biāo）準實驗需消耗至（zhì）少20隻小鼠。據統計，截至2018年，僅在歐盟REACH製度實施框架（jià）下就已有超（chāo）過33,000隻小鼠被用於皮膚致敏性測試（shì）。

那（nà）麽TG 497中所列的動物替代技術（shù）是如何實現的呢？TG 497 所（suǒ）采用的“三選二策略”是基於皮膚致敏性有害結局通（tōng）路中的前三個關鍵事（shì）件所構建的一種綜（zōng）合性評估方法，旨（zhǐ）在判定受試化學物是否具有皮膚致敏潛力。

首先，直接肽反應實驗（DPRA，OECD TG 442C）用於評估第一關鍵事件，即被測物是否具有與（yǔ）蛋白質共價結合形成半抗原的能力。該方法采（cǎi）用合（hé）成的含半胱氨酸或賴氨酸殘基的肽段作為模型受（shòu）體，與被測物共同孵育後，通過測量肽的（de）消耗率評估其反應性（xìng）。反應（yīng）結束後，利用高效液相色譜（pǔ）對肽段殘留量進行定量分析。若肽的消耗（hào）顯著，說明化學物能與肽發生共價反應，具備潛在致敏性，從而完成對半抗原形成關鍵事件的評價。

其次，角質形成細胞激活（huó）試驗（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用於評估第二關鍵事件——角質形成細胞的氧化應（yīng）激與促炎反應激活，該事件在（zài）有（yǒu）害結局通路中處於信號（hào）放大（dà）的早期階段。KeratinoSens™方法基於轉基因（yīn）人永生化角質形（xíng）成細（xì）胞係（xì）HaCaT，該細胞穩定表達一個由抗（kàng）氧（yǎng）化反應元件驅動的熒光素酶報告基因。當潛在致敏（mǐn）物質刺激角（jiǎo）質形成細胞（bāo）時，會引發細胞內應激響應，從而啟（qǐ）動熒光素酶表達。通過測定熒（yíng）光素酶活性，即可定量評（píng）估化學物對該通路（lù）的激活能力，進而判斷其是否誘導角質形成細胞釋放促炎因子。

最後，人源樹突狀（zhuàng）細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬有害結局通路中的第三關鍵事件——樹突狀細胞的激活。在（zài）致敏過程中（zhōng），被測物通過局部炎症信號激活樹突狀細胞，後者在抗原識（shí）別（bié）、處理及向T細（xì）胞提呈抗原的過程中（zhōng）起到（dào）橋梁作用。h-CLAT方法使用人急性單核細胞白（bái）血病細胞係THP-1作為樹突狀細胞的替代模型。當致敏化學（xué）物（wù）作用（yòng）於THP-1細胞後，若具（jù）免疫激活能力，將誘導其表麵共刺激分子（如CD86和CD54）表達上調。通過流式細胞分析檢測這（zhè）些表（biǎo）麵標誌物的相對熒光強度變化（huà），即（jí）可判斷化學物是否具備激活免疫（yì）係統的潛能。

TG 497通過整合上述三（sān）種機（jī）製互補的體外方法，從生物學不同層麵綜合評估皮膚致敏性。隻（zhī）要任意兩項測試結果一致，即可做出（chū）科學、可靠的致敏性判斷，從而（ér）實現在此（cǐ）毒理終點上對動物實（shí）驗的完全替代。這（zhè）三項（xiàng）方法各自針對皮膚致敏有（yǒu）害結局通路中的不同關鍵節點，組合使用（yòng）時（shí）增強了判斷的穩健性和預測（cè）一（yī）致性。

TG 497被（bèi）正式寫入（rù）OECD指南前，其開發團隊以及歐盟替（tì）代方法驗證中心、美國替代方法驗證協調（diào）委員會和日本替代方法驗證中心（xīn）都對其評估能力（lì）進（jìn）行了驗證，並與傳統動物實驗（yàn）方法如局（jú）部淋巴結試驗（yàn）做了對比，結果顯示TG 497在多個核心指標上全麵優於（yú）局部淋巴結試驗。具體表現為：在敏感性上，TG 497達到（dào）了87%，相比之下局部淋巴結試驗為72%，證明前者在識別（bié）真正致（zhì）敏物方麵表現更優；在特異性（xìng）方麵，TG 497為88%，也明顯高於局部淋巴結試驗的（de）75%，證明其在排除非（fēi）致敏物時誤判更（gèng）少；在準確率上，TG 497為87.5%，也高於（yú）局部淋巴（bā）結試驗的73%，證（zhèng）明其在整體預測效（xiào）能（néng）上表現更加平衡；更為關鍵（jiàn）的（de）是，與人體不良反應數據的一致性上TG 497達到了“非常（cháng）高”，而局部淋巴結試驗（yàn）僅為“中等偏高”，這表明TG 497在臨床相關（guān）性上更具優勢。

綜上所述，TG 497不（bú）僅在科學性能上更為出色，而且由於其不依賴動物實驗、與人體數據一致性更高，因此得以成為目前首（shǒu）個被國際監管機構OECD采（cǎi）納（nà）的完（wán）全替代皮膚致敏（mǐn）性動物（wù）試驗的標準體外測試方案。這一指南的頒布也標誌著（zhe）毒理（lǐ）學替代方法（fǎ）從“輔助”邁入“決策級”應用的關鍵進展。

盡管TG 497的成功被視為替代（dài）毒理學（xué）領域的重要裏程碑，但其背後反映（yìng）出的研發過程也暴露了動物替代方法開（kāi）發的諸多難點與局限。之所以能取得突破，首先因為皮膚致敏反應是目前有害結（jié）局通路建立最完善的毒理（lǐ）路徑之一，機製簡單、事件明確、模擬容易。相比之下，神經毒性、免疫毒（dú）性（xìng）、內分泌幹擾等終點路徑複雜，機（jī）製不明確，至今尚無可實現完全替代的體外組合（hé）方法。其次，TG 497研發成功的核心（xīn）優勢還在於擁有有大量來自因斑貼測（cè）試、臨床（chuáng）案例和職業暴露的人體皮膚致敏不良反應數據可用於方法驗證。而多數其它毒理領域（yù）仍嚴重依賴於動物實驗數據，缺乏可比對的人體資料，從而（ér）限製了相應替代方案的實際驗證路徑。即便如此，TG 497成功（gōng）進入OECD指南也曆經了漫長的驗證、標準化（huà）與（yǔ）互認過程。三（sān）項（xiàng）子方法最早提出可追溯至2006年前後，但直至2015年才以單獨測試（shì）方法形式被 OECD 采納，2021年方整（zhěng）合為 TG497——整個流（liú）程（chéng）耗（hào）時（shí）逾10年。

此外TG 497在（zài）皮膚致（zhì）敏評估中仍存在化學品適用範圍的盲區：它僅適用於小分子化學品，對金屬離子、複雜混合物（wù）、親水性或高反應性物質尚不（bú）適用；同時，也（yě）不適用（yòng）於易幹擾測試（shì）係統穩定性的強刺激性或腐蝕性化合物（wù）。

可以說，TG497 的誕生既（jì）是（shì）一道分（fèn）水嶺，也是一麵鏡子：一方麵，它首次證（zhèng）明“綜合測試方案（àn）”完全可以獲得監管層麵的認可，為 OECD 體（tǐ）係內其他毒理終點開發類似方法樹立了範式；另一方麵，它警示我們（men），唯有深入掌握生物機製、係統整合多源數據並實現方法標準化與多中（zhōng）心驗證，替代策略（luè）方能真（zhēn）正落地。更進一步，TG497 的成功表明，替代路徑更適用於機製清晰、易（yì）於體外模擬且人體數據相對充足的毒理終點。總之，替代並非簡化，不是單憑熱情就可以“一蹴而就”的，而是在更高科學規範要求下，通（tōng）過持續演化與完善（shàn）才能（néng）夠得以實現；同（tóng）時，其研發仍離不開動物實驗與人體反應數據的對照與支撐。因此，盡管TG497 為全麵替代動物實驗開了一個好頭，但在所有領域都實現這一目標仍有漫（màn）長的科學探索與製度建設之（zhī）路要走。